据 ClinVar 数据显示,人类约58%的遗传疾病是由于碱基突变引起的(1)。

CRISPR/Cas9技术可实现精确的碱基修复,但其效率低下(0.1%-5%),且存在非靶向切割,高度精确修复能力的极大地限制了广泛的的应用。

碱基编辑系统(base editing)依据nickase Cas9(D10A)融合了不同的碱基修饰酶分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine baseeditors, CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABE)。

这两种碱基编辑器能在不产生DNA双链断裂的情况下,在4-8(距离PAM远端起)窗口内分别实现精准的C•G到T•A或A•T到G•C 的替换,高效、精准和低脱靶的特性使其逐渐成为基因编辑领域的新宠(2,3)。

在疾病模型制作、精准基因治疗、动植物遗传育种,耐药性筛选等领域展现出光明的发展前景(4,5)。

5月11日,华东师范大学李大力课题组Nature Cell Biology杂志报导了一系列新的超高活性胞嘧啶碱基编辑器(https://www.nature.com/articles/s41556-020-0518-8)。

然而,现有的碱基编辑器只能催化单一类型碱基的转换,这限制了其广泛应用。

因此,开发新的碱基编辑器能高效地同时产生两种不同碱基的突变,这既是概念上的创新,也将极大地丰富碱基编辑工具,在基因治疗,物种改良和分子进化等方面都有重要意义。

北京时间2020年6月1日晚23时,李大力和刘明耀课题组Nature Biotechnology杂志再次发表了全新的双碱基编辑器:《Dual base editor catalyzes both cytosine andadenine base conversionsin human cells》。

该研究将人类胞嘧啶脱氨酶hAID-腺嘌呤脱氨酶-Cas9n(SpCas9 D10A突变体)融合在一起,开发了一种新型双功能高活性碱基编辑器-A&C-BEmax,它可以在同一等位基因的靶序列上实现C>T和A>G的高效转换。

与CBE和ABE相比,A&C-BEmax拓宽了C>T的编辑窗口,提高了编辑效率;A>G的窗口保持不变,效率略有下降,RNA脱靶水平大幅降低。

2018年David Liu实验室开发出ABE7.10碱基编辑器后,李大力课题组通过融合识别不同PAM的Cas9变体,大幅提高了ABE在小鼠和大鼠胚胎中的编辑效率的同时大大地拓宽了可编辑的靶点范围(6)。

然而,无论是ABE还是CBE都只能催化单一碱基的转换,在研究ABE的同时,研究团队猜测如果将两种脱氨酶融合到Cas9n,是否能实现两种碱基高效的转换呢?

因此,通过将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶在Cas9n两端融合,构建了五种载体,通过哺乳动物细胞测试,发现将胞嘧啶脱氨酶hAID融合到ABE7.10的N端,展现出A/C同时转换的特性,但此时效率偏低。

为了进一步提高效率,课题组通过密码子、核定位信号、linker序列以及UGI串联等多轮优化获得了一种高效的A/C同时转换的编辑器,并命名为:A&C-BEmax(图1)。

经过上述系列优化,与原始构建体相比,A&C-BEmax的碱基转化效率,产物纯度和A/C同时转换活性显著提高,C(胞嘧啶)的编辑窗口大幅拓宽,且更安全,RNA脱靶率更低。

图1:构建C•G和A•T同时高效转换的碱基编辑器- A&C-BEmax

为了公正地评价A&C-BEmax的性能,科研人员在HEK293T细胞中测试了28个内源性靶点(其中4个靶点仅包含Cs或As)同时和与ABEmax和AID-BE4max进行对比。

测试显示, A&C-BEmax的编辑窗口从C3-C10位扩展到了C2-C17位,在C7-C17位的编辑活性相对于AID-BE4max提高了1.9-14倍,而A>G的编辑效率与ABEmax相似或略有降低,但比ABEmax在RNA上的脱靶率更低,同一等位基因的A和C同时突变效率最高达到30%。

那么这么好的工具有什么独特的用途呢?论文进一步验证了A&C-BEmax在基因治疗中的应用,将A&C-BEmax递送到红细胞前体细胞中(HUDEP-2)。

结果表明,A&C-BEmax能高效地破坏胎儿期血红蛋白基因HBG1/2启动子区域转录抑制因子BCL11A结合位点(-114C>T或-115C>T)并同时创建新的转录激活因子GATA1的结合位点(-113A>G),与周围单独产生C的编辑细胞相比,分化的HUDEP-2细胞中更高的HBG表达水平。

该工作展示了A&C-BEmax这一新型双碱基编辑系统对于精准治疗β-血红蛋白病的巨大潜力。

最后,与杨力课题组合作,通过大数据挖掘,在Clin Var(1)和dbSNP(7) (SNPs)临床数据库中发现了临床中A&C-BEmax可同时靶向AC纠正203个临床报道的致病突变;进一步拓展PAM为NG时, Cas9-靶向范围增加了2.8倍(〜573个)。

即研究的新工具在理论上可对数百种至数千种引起人类疾病的基因组点突变进行定点矫正,因此拥有巨大的临床应用潜力。

研究团队还统计到,A&C-BEmax与ABE或CBE相比,能实现60个额外的密码子更改(18个氨基酸替换),这些更改无法使用现有的单碱基编辑器做到。

与单脱氨酶碱基编辑器相比,A&C-BEmax能高效地同时引入A>G和C>T编辑,因此产生的突变组合多样性更大,且更安全。

除了基因治疗方面,A&C-BEmax还将在谱系追踪、饱和诱变筛选和定向进化等基础研究的应用中展现巨大潜能。

华东师大生命科学学院2016级博士研究生张晓辉,2017级博士研究生朱碧云和2018级硕士研究生陈亮为该论文的共同第一作者,华东师范大学为第一作者单位,李大力教授为本文通讯作者,刘明耀教授参与课题的指导,该课题得到了中国科学院上海生命科学研究院计算生物学研究所杨力研究员团队的大力支持。

该研究得到科技部重点研发计划、国家自然科学基金和上海市教委重大项目等项目的经费支持。

来源:小柯生命

相关论文信息:

DOI:10.1038/s41587-020-0527-y

参考文献 

1. Landrum, M.J. et al. ClinVar: publicarchive of interpretations of clinically relevant variants.  Nucleic Acids Res.44, D862-D868 (2016).

2. Komor, A.C., Kim,Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R.J.N. Programmable editing of atarget base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature.533, 420-424 (2016).

3. Gaudelli, N.M. etal. Programmable base editing of A• T to G• C in genomic DNA without DNAcleavage. Nature.551, 464-471(2017).

4. Yang, B., Yang, L.& Chen, J.J.T.C.j. Development and application of base editors.